Q&A: 轻松掌握Primer5 入门级引物设计全攻略

Primer5作为一款强大的引物设计软件，广泛应用于分子生物学实验中。无论是初学者还是有一定经验的科研人员，都可以通过Primer5设计出高效、特异的PCR引物。以下是一份详细的Primer5入门级引物设计攻略，帮助大家快速上手这款软件。

一、准备工作

1. 安装Primer5

首先，你需要在你的电脑上安装Primer5软件。你可以从官方网站下载最新版本，并按照安装向导进行安装。

2. 查找目的基因的mRNA序列（或cDNA）

在开始设计引物之前，你需要获取目的基因的mRNA序列或cDNA序列。这可以通过以下几种方式实现：

实验室已有的某物种基因组数据库中查找：如果你所在的实验室有自建的基因组数据库，可以直接在其中查找。

NCBI上查找：这是最常用的一种方法。进入NCBI官网，选择Nucleotide，然后在搜索框中输入基因名和物种名（拉丁学名），点击搜索。注意，有时你可能无法直接找到该物种的目的基因，这时可以尝试先找到与该物种亲缘关系相近的目的基因，下载该序列，再利用NCBI上的BLAST工具进行序列比对。

二、设计引物

1. 打开Primer5并导入序列

安装并打开Primer5软件，点击File-New-DNA sequence，在弹出的窗口中粘贴你的cDNA序列，点击As is，然后点击OK。

2. 设计引物参数设置

点击Primer，然后点击Search，在弹出的窗口中调整参数。以下是常见的参数设置：

产物长度：产物长度可以自行调整，一般包括整个目的序列。

引物长度：一般为18-30bp，视情况调整。最常用的是18-24bp，最短不要少于15bp，最长不要超过30bp。

点击OK，会弹出一个新窗口，继续点击OK。这时，Primer5会根据你设置的参数开始搜索引物。

3. 筛选引物

在搜索结果窗口中，你可以看到系统为你设计的多对引物。这些引物会按照评分（Rating）从高到低排序。评分高的引物通常具有较好的特异性和扩增效率。

以下是一些筛选引物的原则：

上下游引物评分：sense（上游引物）和anti-sense（下游引物）的评分最好都是None，评分越高越好。

ΔG绝对值：ΔG绝对值小于10。

Tm值：Tm值一般在55-70℃之间，最好在60℃左右，正负1度。

GC含量：GC含量应在40%-60%之间。

引物末端：末端不能是A，不能有连续3个相同的碱基，3’端一定不能有错配，5’端不要是G。

二级结构：最好没有hairpin（发夹结构）、dimer（二聚体）和false priming（错误引发）。

由于基因序列本身的差异，很难调到所有原则都满足，但可以对系统给出的引物中的前几对进行调整，尽可能满足以上原则。

4. 调整引物

以系统给出的第一对引物为例，虽然系统给出的评分比较高，但下游引物可能出现发夹结构和二聚体，这时可以尝试调整一下。

调整引物位置：点击左上角的A（Anti-sense），当图示的引物与A的颜色一致时，表示展示的是Anti-sense。然后把鼠标的光标放在引物的位置左右滑动，调整上下游引物位置。

删除或添加碱基：点击3’端，序列的位置会跟着移动。如果需要更改默认长度，点击左上角File>preference。点击Edit Primers，即可删除多余的碱基或添加新的碱基。注意编辑引物时，只能从右边添加或删除碱基，如果想在左边添加或删除，需要通过左右移动碱基的位置。

例如，如果某对引物的GC含量过高，可以尝试删除5’端的一个C，降低GC含量。首先把光标放在引物的位置，将引物向后移动一个，观察引物向后移动了一个碱基，长度增加了，此时点击Edit Primers，删除几个碱基后点击Analyze（分析）。

三、导出引物

当你找到满意的引物后，可以将其导出。首先，打开一个Excel文件，然后在Primer5中点击Edit-copy-sense primer，粘贴到Excel中；再点击Edit-copy-Anti sense primer，粘贴到Excel中。

四、注意事项

1. 产物长度：产物长度最好大于100bp，小于300bp，也可以到400bp。如果产物长度太短，琼脂糖凝胶电泳时条带会很模糊。

2. 搜索参数：Search parameters可以选择Manual，Search stringency应选High。如果没有特殊要求，